در این پست ما کاربامات ها را به عنوان یک گروه محافظ مفید برای آمین ها به ویژه در زمینه ساخت پپتیدها معرفی می کنیم.

1. مقدمه ای بر سنتز ساده پپتید

در پست اخیر [آمیدها: سنتز، خواص، و نامگذاری] ما از طریق 3 روش متداول برای ساخت آمیدها آشنا شدیم:

افزودن آمین ها به آسیل هالیدها / انیدریدها
هیدرولیز جزئی نیتریل ها
جفت شدن کربوکسیلیک اسیدها با آمین ها با استفاده از یک عامل آب زدایی مانند DCC (N,N’-dicyclohexylcarbodiimide).

چیزی که در آن پست گم شده بود، ذکری از سنتز پدربزرگ مفیدترین پیوندهای آمیدی شناخته شده برای بشر بود، و منظور من از آن پپتیدها بود.

پیوند پپتیدی نامی است که ما به پیوند آمیدی می دهیم که دو اسید آمینه را به هم می پیوندد.

و آمینو اسیدها مهم هستند زیرا… صبر کنید. شما قبلاً می دانید که چرا اسیدهای آمینه مهم هستند، درست است؟ اگر در حال حاضر این را نمی دانید، پس از خواندن این مطلب برگردید.

2. بیایید یک دسته گلی آلا را با هم مخلوط کنیم

بیایید سعی کنیم برخی از مهارت های جدید سنتز آمید را برای ساختن یک دی پپتید واقعا ساده، گلیسین-آلانین به کار ببریم. اگر اکنون بتوانیم یک دی پپتید ساده بسازیم، می‌توانیم از آموخته‌های خود برای نشان دادن چگونگی ساخت پپتیدهای پیچیده‌تر در پست بعدی استفاده کنیم. [نگاه کنید به پست: مقدمه‌ای بر سنتز پپتید] آیا می‌دانستید بروس مریفیلد، برنده جایزه نوبل، انسولین را با پیوستن یک اسید آمینه به یکدیگر در یک زمان تولید کرد؟ آره واقعا.

از سه روشی که برای ساخت آمیدها فهرست کردیم، تنها دو روش بالقوه برای تشکیل پیوندهای پپتیدی مفید هستند: 1) روش کلرید اسید، یا 2) سنتز از طریق یک عامل جفت کننده مانند DCC. [هیدرولیز نیتریل‌ها فقط آمیدهای اولیه، R-CONH2 را فراهم می‌کند، بنابراین گزینه‌ای برای سنتز پپتید نیست].

3. یک طرح اولیه بسیار بد

اولین ضربه ما به سنتز پپتید شامل حرکت به جلو با یک طرح حمله بسیار ساده لوحانه خواهد بود و امیدواریم که در پایان همه چیز به نتیجه برسد. صبر کنید، زیرا قرار است به هم ریخته شود.

ما با پیشنهاد روش کلرید اسید [یا واکنش شوتن-باومن، در صورت تمایل] برای سنتز Gly-Ala شروع خواهیم کرد.

با نگاهی به گذشته از دی پپتید Gly-Ala، برنامه ما از ما می خواهد که پیوند پپتیدی را از طریق واکنش آلانین با کلرید اسید حاصل از گلیسین سنتز کنیم:

این طرح یک مشکل جزئی دارد. شاید در ابتدا تشخیص آن کمی سخت باشد.

بیایید فرض کنیم که کلرید اسید گلیسین را ساخته‌ایم [توجه]، و «کلرید اسید گلیسین» و آلانین را با هم در یک فلاسک داریم، همراه با مقداری باز اضافی برای سرعت بخشیدن به کارها. [توجه داشته باشید – یک جزئیات جزئی در اینجا حذف شده است: ماهیت zwitterionic اسیدهای آمینه]

ما واکنش را در جهت جلو ترسیم می کنیم:

چه چیزی ممکن است اشتباه باشد؟

4. «هارک! این چه مزخرفی است؟ ”

برنامه ما این است که محلولی از کلرید اسید گلیسین (1 معادل مولی) بسازیم و سپس آن را با صبر و حوصله در فلاسک صبر کنیم تا یک معادل مولی آلانین به آن اضافه کنیم، و سپس با گروه نوکلئوفیل NH2 آلانین واکنش نشان دهیم.

مشکل طرح ما این است که با یک مولکول «کلرید اسید گلیسین» سروکار نداریم، بلکه با چیزی در اطراف یک مول (6.02×1023 مولکول) از آن سروکار داریم. و اسید کلرید گلیسین در حال حاضر دارای یک گروه NH2 هسته دوست است!

“کلرید اسید گلیسین” همانطور که ترسیم شده است، یک مولکول پایدار نیست، زیرا می تواند با خود واکنش نشان دهد.

این بدان معناست که محلولی از کلرید اسید گلیسین که به حال خود رها می شود، پلیمری از گلیسین را با ساختار Gly-Gly-Gly-Gly تشکیل می دهد.

حتی محلول گلیسین اسید کلرید در حضور آلانین نه تنها گلای آلا مورد نظر را تشکیل می دهد، بلکه گلی-گلای (با یک آسیل هالید متصل) را نیز تشکیل می دهد که می تواند با یک هسته دوست دیگر، خواه گلای، شیطنت بیشتری انجام دهد. یا آلا:

(و نه، چیز زیادی برای تشخیص NH2 “کلرید اسید گلیسین” از NH2 آلانین وجود ندارد. آنها تقریباً به همان اندازه واکنش پذیر هستند.)

درسی که در اینجا وجود دارد این است که وقتی محلولی از یک مولکول حاوی یک نوکلئوفیل و یک الکتروفیل دارید، می تواند خود واکنش نشان دهد. نامی برای این فرآیند وجود دارد که ممکن است آشنا به نظر برسد: پلیمریزاسیون.

پس چگونه جلوی این اتفاق را بگیریم؟

5. کلاه محافظ برای NH2

بهترین راه این است که نیتروژن را به نحوی با یک گروه محافظ (PG) که گروه NH2 را غیرهسته دوست می کند، «درپوش» قرار دهیم. همچنین باید دارای خواص زیر باشد:

به راحتی و انتخابی نصب می شود
نسبت به شرایط واکنش مورد نظر بی اثر باشد (به عنوان مثال، SOCl2 برای ساخت کلرید اسید از اسید کربوکسیلیک)
به راحتی و به طور انتخابی بدون تأثیر بر روی پری نهایی حذف می شود

خروجی

ما قبلاً استراتژی‌های محافظت از گروه را دیده‌ایم، به ویژه با الکل‌ها و استفاده از معرف‌های گریگنارد.

در اینجا یک استراتژی گروه محافظتی برای ترکیب ما از “Gly-Gly” ممکن است به نظر برسد. ما یک گروه محافظ (“PG”) روی گلیسین نصب می کنیم، سپس اسید کلرید را می سازیم. PG باید به گونه ای انتخاب شود که نیتروژن را غیر هسته دوست کند (یعنی با کلرید اسید واکنش نشان ندهد).

سپس می توانیم پیوند پپتیدی خود را با آلانین محافظت نشده تشکیل دهیم و سپس PG را در شرایط ملایم حذف کنیم.

یکی از استراتژی‌های گروه محافظتی برای نیتروژن که قبلاً بررسی کرده‌ایم، سنتز گابریل است که از فتالیمید استفاده می‌کند (شما می‌توانید فتالیمید را به عنوان یک نیتروژن محافظت‌شده در نظر بگیرید). این در واقع برای سنتز Gly-Gly (“گلیسیل گلیسین”) استفاده شده است [یادداشت 2]! با این حال، یکی از مشکلات این است که شرایط نسبتاً سخت (حرارت کافی) برای نصب و حذف گروه فتالیمید مورد نیاز است و این محیط چندان سالمی برای بقای اسیدهای آمینه حساس و کایرال نیست که به راحتی می توانند راسمیزه شوند.

انتخاب بالقوه دیگر محافظت از نیتروژن به عنوان یک آمید است، اما آمیدهای برش می توانند به شرایط سخت نیز نیاز داشته باشند. علاوه بر این، از آنجایی که ما در حال تلاش برای ایجاد پیوند آمیدی (پپتید) در اینجا هستیم، ممکن است با حذف آن مشکل انتخابی داشته باشیم – تخریب دهکده برای نجات آن. [یادداشت پیشرفته]

6. رفیق! از یک کاربامات استفاده کن، همسر! [مرجع]

محبوب ترین انتخاب گروه محافظ برای نیتروژن آمین، گروه عملکردی کاربامات است. یک کاربامات شبیه بچه حرامزاده یک استر و یک آمید است که N و O در کنار یک کربونیل قرار دارند.

نیتروژن یک کاربامات نسبتاً غیر هسته دوست است و علاوه بر این، کاربامات ها عبارتند از:

به راحتی روی نیتروژن نصب می شود
نسبت به طیف گسترده ای از شرایط واکنش بی اثر است
به راحتی بدون تأثیر بر گروه های آمید موجود حذف می شود

این آنها را برای اهداف ما عالی می کند.

7. Boc و CBz زانوهای زنبور عسل هستند

دو گروه محبوب محافظ کاربامات عبارتند از Boc (t-Butyloxycarbonyl) و CBz (کربوکسی بنزیل).

برای اهداف ما، این دو گروه محافظ را می توان کم و بیش معادل هم در نظر گرفت، زیرا می توان از هر یک به طور موثر برای سنتز پپتید استفاده کرد.

تفاوت اصلی واقعاً در نحوه حذف آنها است (یعنی مرحله “حفاظت زدایی”). هنگامی که یک مولکول پیچیده با گروه های محافظ متعدد دارید، انتخاب بین یکی یا دیگری بسیار مهم می شود. که در دسته “استراتژی مصنوعی پیشرفته” قرار می گیرد که بیشتر موضوعی برای Org 3 است. [یادداشت 3]

8. نصب و حذف گروه حفاظتی “Boc”.

گروه Boc معمولاً با “Boc2O” نصب می شود (گاهی اوقات به عنوان “Boc anhydride” نامیده می شود) و با اسید حذف می شود. انتخاب معمولی اسید تری فلورواستیک (TFA) “تمیز” (یعنی رقیق‌نشده) است که گروه‌های Boc را کاملا تمیز می‌کند و CO2 و الکل تی بوتیل را آزاد می‌کند.

9. نصب و حذف گروه محافظ کاربامات CBz (یا Z)

گروه Cbz (گاهی اوقات به اختصار “Z”) را می توان با CbzCl و پایه ملایم نصب کرد و معمولاً از طریق هیدروژناسیون کاتالیزوری (Pd-C/H2) حذف می شود. این بسیار ملایم است و این مزیت را دارد که در PH خنثی رخ می دهد و گروه های عاملی حساس به اسید یا باز را به تنهایی می گذارد.

10. سنتز ساده پپتید با استفاده از گروه های محافظ کاربامات

بیایید به سنتز پپتید برگردیم و این استراتژی گروه محافظ را برای ساخت Gly-Ala اعمال کنیم.

ما با یک اسید آمینه مانند ال-آلانین شروع می کنیم. با درمان آلانین با Boc2O، L-آلانین محافظت شده N-Boc را بدست می آوریم. مرحله بعدی تشکیل یک کلرید اسید با استفاده از SOCl2 است. پس از تشکیل، آمین خود (مثلاً ال والین) را در حضور باز اضافی اضافه می کنیم و پیوند آمیدی کلیدی خود را تشکیل می دهیم. آخرین مرحله برای دادن دی پپتید، محافظت از آمین محافظت شده با Boc با اسید تری فلورواستیک (TFA) و voila است! ما دیپپتید خود را داریم.

اگرچه این روش ممکن است روی کاغذ خوب باشد، اما یکی از مشکلات استفاده از کلریدهای اسیدی در عمل این است که اسیدهای آمینه کایرال اغلب خلوص نوری خود را از طریق این روش از دست می دهند، فرآیندی که گاهی اوقات به عنوان “راسمی شدن” نامیده می شود، اما به درستی آن را “اپیمریزاسیون” می نامند (از لحاظ فنی بیشتر درست است، زیرا یک هیدروژن در مرکز کایرال معکوس است)

از آنجایی که کایرالیته اسیدهای آمینه برای عملکرد بیولوژیکی آنها ضروری است، معمولاً از پروتکل کمی ملایم تر استفاده می شود که از DCC یا یک معرف جفت کننده مشابه استفاده می کند.

در اینجا، ما گلیسین محافظت شده با Boc را با DCC درمان می کنیم تا کربوکسیلیک اسید را فعال کنیم. سپس آمینو اسید نوکلئوفیل خود (ال-آلانین) را اضافه می کنیم که دی پپتید را تشکیل می دهد. اگر بخواهیم دی پپتید Gly-Ala را در این مرحله جدا کنیم، می توانیم گروه Boc را با TFA حذف کنیم.

(توجه به این طرح)

11. ادامه دارد…

توجه داشته باشید که اگر می‌خواهیم یک پپتید تری بسازیم، می‌توانیم چرخه‌های افزودن DCC (برای فعال کردن اسید کربوکسیلیک) و سپس افزودن اسیدهای آمینه جدید را ادامه دهیم و پپتید را یک واحد در یک زمان بسازیم!

روشی به ویژه موثر برای ساخت پپتیدهای طولانی‌تر وجود دارد که توسط بروس مریفیلد (و در سنتز انسولین، در میان دیگران به کار می‌رود) به نام سنتز پپتید فاز جامد وجود دارد که دفعه بعد به آن خواهیم پرداخت.

عکس

یادداشت

نکته 1. مشابه شوخی قدیمی درباره اقتصاددانی که طرحی برای پیاده شدن از یک جزیره بیابانی پیشنهاد می کند:

“فرض کنید ما یک قایق داریم.”

گلیسین (مانند همه اسیدهای آمینه) خود یک زوئیتریون است. درمان گلیسین با SOCl2 باید کلرید اسید را با یک آمین پروتونه تولید کند. این باید در محلول نسبتاً پایدار باشد تا زمانی که پایه اضافه نشود.

مشکل اینجاست از آنجایی که آمینو اسید نوکلئوفیل ما (آلانین) نیز زوئیتریونی است، تا زمانی که باز اضافی برای آزاد کردن یک جفت تنها روی نیتروژن آلانین اضافه نشود، هیچ واکنشی رخ نمی دهد. پس از افزودن باز، “گلیسین اسید کلرید” و آلانین را با هم در محلول داریم. تفاوت قابل ملاحظه ای در هسته دوستی بین نیتروژن های این دو گونه وجود ندارد و هر یک از آنها برای واکنش با نوکلئوفیل اسید کلرید رقابت می کنند که منجر به مخلوطی از Gly-Ala و Gly-GlyCl می شود و سپس Gly-GlyCl می تواند واکنش نشان دهد. بیشتر با نوکلئوفیل های مختلف از پیش تعیین شده در محلول، پپتیدهای تری، تترا و بالاتر را ارائه می دهند.

یادداشت 2. جان شیهان، که قبلاً به عنوان مخترع DCC در مسیر اولین تولید کننده پنی سیلین برای سنتز پنی سیلین ملاقات کردیم، همچنین Gly-Gly محافظت شده از فتالیل را از طریق سنتز گابریل ساخت:

ارجاع به اینجا (JACS، 1949، 71، 1856)

نکته 3. یکی دیگر از مشکلات استفاده از گروه های محافظ آمید، تشکیل آزلاکتون است که می تواند منجر به اپیمر شدن اسیدهای آمینه کایرال شود. مجموعه این مشکل را نیز ببینید.

تبصره 4. “گروه های محافظ متعامد”. در برنامه‌ریزی مصنوعی، اغلب داشتن گروه‌های محافظی که تحت شرایط کاملاً متفاوت قابل جابجایی هستند، بسیار مهم است. این ویژگی اغلب به عنوان “متعامد” نامیده می شود

به عنوان مثال در دی پپتید زیر دو گروه مختلف محافظ روی نیتروژن داریم – یکی Boc و دیگری CBz. با انتخاب گروه‌های محافظ «متعامد»، هر نیتروژن آدرس‌پذیر است – می‌توانیم انتخاب کنیم کدام گروه محافظ را حذف کنیم، و سنتز ما می‌تواند از آنجا ادامه یابد. این از وارد شدن به موقعیتی جلوگیری می کند که در آن ما دو آمین محافظت نشده داریم و باید به واکنش پذیرتر بودن یکی نسبت به دیگری تکیه کنیم. این رویکردها به ندرت کار می کنند!

یک نکته – برای سادگی در اینجا آلانین با یک اسید کربوکسیلیک آزاد نشان داده می شود، اما یک رویکرد کمی بهتر استفاده از متیل استر آلانین برای جلوگیری از هر گونه خود جفت شدن بین آمین آزاد آلانین و اسید کربوکسیلیک آزاد است.

رفیق…

(پیشرفته) مراجع و مطالعه بیشتر

کاربامات ها به عنوان گروه های محافظ برای آمین ها مفید هستند و رایج ترین آنها -Boc، -Cbz و -Fmoc هستند.

Über ein allgemeines Verfahren der Peptid-Synthese
ماکس برگمان و لئونیداس زرواس
بر. 1932، 65 (7)، 1192-1201
DOI: 10.1002/cber.19320650722
گروه محافظ -Cbz (کربوکسی بنزیل) اولین بار توسط ماکس برگمان و لئونیداس زرواس در سال 1932 برای سنتز پپتیدها استفاده شد و گاهی اوقات به افتخار زرواس به اختصار “-Z” خوانده می شود.
حذف گروه های محافظ تی بوتیل و تی بوتوکسی کربونیل با اسید تری فلوئورواستیک
مکانیسم ها، تشکیل دو محصول و ارزیابی رفتگران
بهrend F. Lundt، Nils L. Johansen، Aage Vølund و Jan Markussen
جی. پپت. Prot. Res. 1978، 12 (5)، 258-268
DOI: 10.1111/j.1399-3011.1978.tb02896.x
در عمل، جاذب‌های هسته‌دوست (مانند تیول‌ها) معمولاً هنگام محافظت‌زدایی به کوکتل اسیدی (TFA) اضافه می‌شوند، زیرا محافظت‌زدایی از Boc گونه‌های الکتروفیل t-butyl (مانند t-butyl trifluoroacetate) را ایجاد می‌کند که می‌توانند با باقیمانده‌های حساس واکنش دهند (مثلا T. Cys).
روشی برای سنتز زنجیره های پپتیدی طولانی با استفاده از سنتز اکسی توسین به عنوان مثال
میکلوس بودانسکی و وینسنت دو وینیو
مجله انجمن شیمی آمریکا 1959، 81 (21)، 5688-5691
DOI: 1021/ja01530a040
در نیمه اول قرن بیستم، سنتز پپتید با استفاده از تکنیک‌های استاندارد فاز محلول شیمی آلی انجام شد. این در حال حاضر به عنوان LPPS (سنتز پپتید فاز مایع) شناخته می شود. دو وینیو در سال 1955 جایزه نوبل شیمی را به دلیل کارش در نشان دادن اینکه سنتز پپتید را می توان با استفاده از انتخاب صحیح گروه های حفاظتی و استراتژی های مصنوعی به دست آورد، دریافت کرد.
تشکیل موقت حلقه آزلاکتون در راسمیزه کردن مشتقات آسیل آمینو اسیدها با انیدرید استیک
Vincent du Vigneaud و Curtis E. Meyer
Biol. شیمی. 1932، 99:143-151
http://www.jbc.org/content/99/1/143.citation
یکی دیگر از مشکلات استفاده از گروه های محافظ آمید، تشکیل آزلاکتون است که می تواند منجر به اپیمر شدن اسیدهای آمینه کایرال شود.
یک مسیر مصنوعی جدید برای پپتیدها
جان سی. شیهان و ویکتور اس. فرانک
مجله انجمن شیمی آمریکا 1949، 71 (5)، 1856-1861
DOI: 10.1021/ja01173a095
جان شیهان، مخترع DCC در مسیر اولین سنتز پنی سیلین، همچنین Gly-Gly محافظت شده با فتالیل را از طریق سنتز گابریل ساخت.
روشی جدید برای تشکیل پیوندهای پپتیدی
جان سی. شیهان و جورج پی هس
مجله انجمن شیمی آمریکا 1955، 77 (4)، 1067-1068
DOI: 1021/ja01609a099
مقاله اصلی در مورد سنتز پیوندهای پپتیدی / پیوندهای آمیدی با استفاده از DCC.
تابع 9-Fluorenylmethoxycarbonyl، یک گروه جدید محافظ آمینو حساس به باز
لوئیس آ. کارپینو و گریس وای هان
مجله the American Chemical Society 1970, 92 (19), 5748-5749
DOI: 10.1021/ja00722a043
9-گروه محافظ آمینو فلورنیل متوکسی کربونیل
لوئیس آ. کارپینو و گریس وای هان
مجله شیمی آلی 1972 37 (22), 3404-3409
DOI: 10.1021/jo00795a005
کشف و توسعه گروه محافظ -Fmoc برای آمین ها، قائم به لایه دیگری را به استراتژی های حفاظت/حفاظت آمین اضافه می کند. گروه -Fmoc حساس به پایه است و در سنتز پپتید معمولاً با 20٪ پیپریدین در DMF حذف می شود. Cbz با هیدروژناسیون، -Boc با اسید و -Fmoc با باز حذف می شود.