پیوندهای پپتیدی: تشکیل پپتید از اسیدهای آمینه با استفاده از گروه های محافظ

امروز ما در مورد چگونگی سنتز مهم ترین آمیدها – پپتیدها – با کمک مهمی از محافظت از شیمی گروه عمیق تر خواهیم کرد.

 

“پیوند پپتیدی” یک پیوند آمیدی است (به Amides: Properties. Synthesis, and Nomenclature مراجعه کنید) که دو اسید آمینه را مانند “دی پپتیدها” L-phenylalanyl-L-valine (در پایین سمت چپ) و L-leucyl-L- به هم متصل می کند. آلانین (در پایین سمت راست):

2. آمینو اسیدهای “پروتئین زا”.

اسیدهای آمینه پروتئین زا بلوک های سازنده پروتئین ها هستند. علاوه بر 20 اسید آمینه ای که مستقیماً توسط ژنوم کدگذاری می شوند، دو اسید آمینه دیگر نیز تحت شرایط خاص به پروتئین ها کد می شوند: سلنوسیستئین (موجود در یوکاریوت ها، از جمله انسان) و پیرولیزین (که فقط در باکتری های تولید کننده متان یافت می شود).

به استثنای گلیسین (آکیرال)، همه اسیدهای آمینه پروتئین زا L-آمینو اسید هستند، که در آن پیشوند “L-” استریوشیمی اسید آمینه را نسبت به L-گلیسرآلدئید مرتبط می کند [به پست: D و L قندها مراجعه کنید].

از آمینو اسیدهای کایرال، همه S هستند، به استثنای سیستئین و سلنوسیستئین (زیرا گوگرد و سلنیوم در سیستم CIP اولویت بیشتری دارند.)

3. سنتز یک دی پپتید ساده بدون گروه های محافظ (توصیه نمی شود!)

بیایید یک دی پپتید ساده بین دو تا از این اسیدهای آمینه بسازیم. برای سادگی، ما دو مورد را از گروه «زنجیره جانبی آبگریز» انتخاب می‌کنیم، آلانین (Ala) و لوسین (Leu)، زیرا زنجیره‌های جانبی آن‌ها به گروه‌های محافظ اضافی نیاز ندارند.

برای ساخت L-Ala-L-Leu باید چه کار کنیم؟

بررسی روش هایی که قبلا برای ساخت آمیدها پوشش داده شده بود، ممکن است ساده به نظر برسد.

چرا 1 معادل از هر یک از ال-آلانین و ال-فنیل آلانین مصرف نمی کنید، یک عامل جفت کننده مانند N,N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) اضافه نمی کنید و صبورانه منتظر ظاهر شدن محصول خود نمی شوید؟

چه چیزی ممکن است اشتباه باشد؟

خب، این مقداری از محصول مورد نظر ما را به ما می‌دهد. اما این کار را به طور موثر انجام نمی دهد!

این به این دلیل است که هر اسید آمینه دارای دو پایانه واکنشی است – یک آمین و یک اسید کربوکسیلیک – و آنها می توانند به روش های مختلفی با یکدیگر پیوند برقرار کنند.

همانطور که حروف A و L می توانند با هم ترکیب شوند تا کلمات AL و LA را بسازند، علاوه بر Ala-Leu (محصول مورد نظر ما) Leu-Ala نیز دریافت خواهیم کرد.

علاوه بر این، از آنجایی که ما مولکول‌های منفرد را با هم اضافه نمی‌کنیم، بلکه مقادیر مولی را اضافه می‌کنیم (حتی یک میلیونیم مول (یک میکرومول) دارای 1017 مولکول است)، همچنین امکان تشکیل «هومو دی پپتید» AA را داریم (Ala- Ala) و LL (Leu-Leu).

و این فقط یک شروع است. مهم نیست که چگونه آن را برش می دهید، به دنبال بازدهی پایین (<25٪) از مواد مورد نظر هستید.

این ناکارآمد، بیهوده و گران است! آیا راه بهتری وجود ندارد؟

4. سنتز یک دی پپتید با استفاده از یک استراتژی گروه محافظ

آره. به جای استفاده از اسیدهای آمینه بومی و فقط دعا برای بازدهی خوب، می‌توانیم از نسخه‌های محافظت‌شده L-Alanine و L-Leucine استفاده کنیم.

اگر از کربوکسیلیک اسید لوسین به عنوان یک استر (مثلاً متیل استر) محافظت کنیم و از آمین ال-آلانین به عنوان یک کاربامات محافظت کنیم (نگاه کنید به: کاربامات ها به عنوان گروه های محافظ) در این صورت وضعیتی ایجاد می کنیم که در آن یک هسته دوست و یک تک الکتروفیل

این منجر به بازده بالا (بیش از 95٪) از یک محصول می شود!

[توجه: گروه Boc یک گروه محافظ کاربامات محبوب برای آمین ها است. “Boc” مخفف t-butyloxycarbonyl]

5. سنتز پپتیدهای طولانی تر – تری پپتیدها و تتراپپتیدها

خبر خوب این است که ما مجبور نیستیم روی دیپپتید متوقف شویم. اگر گروه‌های محافظی را انتخاب کنیم که می‌توانند به‌طور انتخابی حذف شوند (و جفت کاربامات/استر واجد شرایط هستند)، سپس می‌توانیم از کاربامات محافظت کنیم و یک اسید آمینه سوم اضافه کنیم.

انتخاب گروه محافظ کاربامات در اینجا t-butoxycarbonyl (Boc) بود که با اسید قوی (تری فلورواستیک اسید، به اختصار TFA) حذف می‌شود.

درمان با TFA گروه Boc را حذف می کند اما متیل استر را تنها می گذارد.

بنابراین اگر دی پپتید را با TFA درمان کنیم، نیتروژن آمینی را آزاد می‌کنیم و می‌توانیم با یک اسید آمینه محافظت‌شده با Boc دیگر در حضور DCC واکنش نشان دهیم تا یک تری پپتید به دست آوریم.

اگر مشتاق باشیم، حتی می‌توانیم همین روش را برای ساختن یک تتراپپتید، یک پنتاپپتید… یا فراتر از آن گسترش دهیم!

بی دلیل نیست که این روش را برای پپتیدهای طولانی تر در نظر بگیرید.

به عنوان مثال، چیزی مانند برادی کینین، یک زنجیره 9 پپتیدی که باعث گشاد شدن رگ‌های خونی و کاهش سریع فشار خون می‌شود، مصرف کنید. (بدن شما در پاسخ به نیش مار، برادی کینین آزاد می کند، که در ابتدا کشف شد.)

شاید جالب باشد که انواع برادی کینین را سنتز کنیم که در آن برخی از اسیدهای آمینه با آمینو اسیدها جایگزین می شوند. برای انجام این کار، باید بتوانیم آن را سنتز کنیم.

پس چقدر می تواند موثر باشد؟

اگر

هر مرحله جفت پپتید بازدهی حدود 95 درصد دارد، پس بازده کلی ما برای ساخت برادی کینین 95/0 یا 63 درصد خواهد بود. این در واقع خیلی خوب است! بسیاری از شیمیدانان خوشحال خواهند شد که بازدهی 63% را برای یک واکنش واحد بدست آورند، بگذارید به شما بگویم.

اگر بازده به اندازه کافی بالا باشد، حتی می توان ساخت چیزی دیوانه کننده مانند انسولین (51 باقیمانده پپتید) را تصور کرد. این 7٪ بازده برای 51 مرحله است.

آیا این ممکن است؟

بله… اما نیاز به یک اصلاح هوشمندانه دارد که مخترع آن، بروس مریفیلد، جایزه نوبل شیمی 1984 را به ارمغان آورد.

6. موضوع جایزه: سنتز پپتید فاز جامد

آنچه در زیر می آید بیشتر از هر چیز دیگری مکمل است، اما با توجه به اهمیت موضوع، هم جالب و هم مفید است.

در سال 1963 شیمیدانی در دانشگاه راکفلر به نام بروس مریفیلد مقاله ای را منتشر کرد که انقلابی در نحوه سنتز پپتیدها ایجاد کرد و در نهایت سنتز پپتیدهای طولانی را به روال عادی تبدیل کرد.

عنوان آن: «سنتز پپتید فاز جامد. I. سنتز یک تتراپپتید.

ایده کلیدی اینجاست.

به یاد بیاورید که در طرح اصلی خود (در بالا) از کربوکسیلیک اسید به عنوان یک متیل استر محافظت کردیم که در کل سنتز پپتید یکسان می ماند.

ایده مریفیلد این بود: اگر راهی برای اتصال اسید کربوکسیلیک به یک گروه عاملی که خود به یک مهره پلیمری مرتبط است پیدا کنیم، چه؟ این نه تنها از کربوکسیلیک اسید محافظت می کند، بلکه به شدت سهولت جداسازی را بهبود می بخشد.

چرا؟ زیرا به جای اینکه محصول نهایی را با کریستالیزاسیون یا کروماتوگرافی ستونی خالص کنید، با فیلتر کردن دانه های پلیمری (هر 200-500 میکرومتر) و شستن آنها برای حذف معرف های اضافی، خالص سازی می کنید.

خود دانه های پلیمری بسیار کوچک هستند. اندازه معمولی 200 میکرومتر است. هر مهره می تواند حدود 4 نانومول اسید آمینه بارگیری کند.

[براندون فینلی از ChemTips تصویری را در اینجا نشان می دهد]

ویدیوی ارسال شده در زیر مال من نیست، اما ایده ای از روند را به شما می دهد.

در حدود 0:34 می توانید ببینید که مهره ها چقدر کوچک هستند.

نقطه شروع فرآیند مریفیلد پلی استایرن شبکه ای است. که مانند یک مولکول بزرگ به هم پیوسته رفتار می کند. پلی استایرن سپس به یک پیوند دهنده متصل می شود که معمولاً به گروه NH2 ختم می شود. این خود معمولاً محافظت می‌شود. برای فعال کردن پیوند دهنده، باید درپوش محافظ گروه را بردارید.

مهره پلیمری باید در یک حلال متورم شود تا گروه های عاملی روی تکیه گاه جامد به طور موثر تحت واکنش قرار گیرند.

روش ضروری این است: تورم -> افزودن معرفها -> صبر کنید -> فیلتر -> شستشو و تکرار کنید. دانه ها در تمام مدت در ظرف واکنش می مانند. همچنین معمولاً نوعی مرحله درپوش وجود دارد تا مطمئن شوید که آمین‌های واکنش‌دهنده در واکنش بعدی شرکت نمی‌کنند.

از این طریق می توان پپتیدهایی تا حدود 50 واحد ساخت. در سیستم های بسیار خودکار می توان بلندپروازتر بود.

مریفیلد در دهه 1960 شروع به حذف پپتیدها کرد. برادی کینین در 8 روز و بازده کلی 68 درصد ساخته شد. یک مثال. دو سال بعد انسولین ساخته شد. دستاورد این دوره اولیه احتمالاً ریبونوکلئاز A بود که دارای 150 باقیمانده اسید آمینه است.

فرآیند اصلی Merrifield به طور قابل توجهی اصلاح و بهبود یافته است. در اصل، حذف پیوند دهنده به شرایط سخت (اسید قوی) نیاز داشت. امروزه، رویه‌ها معمولاً از گروه‌های محافظ FMOC به‌جای BOC استفاده می‌کنند که امکان محافظت با پایه آمین ملایم (پیپریدین) را فراهم می‌کند. متعاقباً کهکشانی از رزین‌ها، پیوند دهنده‌ها و روش‌های جفت‌سازی جدید ایجاد شده است. مقاله ویکی پدیا در مورد سنتز پپتید فاز جامد محل خوبی برای شروع است.

یادداشت

نکته 1. سیستئین (و سلنوسیستئین) L، اما R هستند، زیرا گوگرد در سیستم Cahn-Ingold-Prelog اولویت بیشتری دارد.

(پیشرفته) مراجع و مطالعه بیشتر

این یک موضوع اصلی است، زیرا سنتز پپتیدها یک صنعت جهانی میلیارد دلاری است.

سنتز یک آمید اکتاپپتید با فعالیت هورمونی اکسی توسین
وینسنت دو وینیو، شارلوت رسلر، کالج جان ام. سوان، کارلتون دبلیو رابرتز، پانایوتیس جی. کاتسویانیس و ساموئل گوردون
مجله انجمن شیمی آمریکا 1953، 75 (19)، 4879-4880
DOI: 1021/ja01115a553
سنتز اکسی توسین
Vincent du Vigneaud، Charlotte Ressler، John M. Swan، Carleton W. Roberts و Panayotis G. Katsoyannis
مجله انجمن شیمی آمریکا 1954، 76 (12)، 3115-3121
DOI: 1021/ja01641a004
روشی برای سنتز زنجیره های پپتیدی طولانی با استفاده از سنتز اکسی توسین به عنوان مثال
میکلوس بودانسکی و وینسنت دو وینیو
مجله انجمن شیمی آمریکا 1959، 81 (21)، 5688-5691
DOI: 1021/ja01530a040
در نیمه اول قرن بیستم، سنتز پپتید با استفاده از تکنیک‌های استاندارد فاز محلول شیمی آلی انجام شد. این در حال حاضر به عنوان LPPS (سنتز پپتید فاز مایع) شناخته می شود. du Vigneaud جایزه نوبل شیمی را در سال 1955 به دلیل کارش در نشان دادن اینکه سنتز پپتید را می توان با استفاده از انتخاب صحیح گروه های محافظتی و استراتژی های مصنوعی به دست آورد، دریافت کرد. سنتز پپتیدبا ارائه روش SPPS (Solid-Phase Peptide Synthesis) که سنتز زنجیره های پپتیدی طولانی را بسیار امکان پذیرتر می کند. پایانه C به رزین پلیمری متصل می‌شود و اسیدهای آمینه یکی یکی به دنبال همان چرخه اضافه می‌شوند: محافظت‌زدایی، شستشو، جفت شدن اسید آمینه بعدی (با یک معرف جفت‌کننده پپتیدی مانند DCC)، شستشو، محافظت‌زدایی دوباره پایانه N و غیره. روش مریفیلد به دلیل استفاده از گروه‌های محافظ (Boc برای اتم‌های نیتروژن و Bzl (بنزیل) برای زنجیره‌های جانبی، استراتژی Boc/Bzl نام گرفت. نکته مهم این است که جداسازی نهایی پپتید از رزین با استفاده از این روش به HF بدون آب نیاز دارد که کنترل آن آسان نیست.
سنتز پپتید فاز جامد. I. سنتز یک تتراپپتید
R. B. Merrifield
مجله انجمن شیمی آمریکا 1963، 85 (14)، 2149-2154
DOI: 10.1021/ja00897a025
این مقاله ای است که همه چیز را آغاز کرد – یک انتشارات تک نویسنده توسط پروفسور مریفیلد با استفاده از روش SPPS برای ساخت یک تتراپپتید. این مقاله حتی امروز یکی از پربازدیدترین و پراستنادترین مقالات در JACS است.
سنتز انسولین گاوی به روش فاز جامد
مارگلین و آر بی مریفیلد
مجله انجمن شیمی آمریکا 1966، 88 (21)، 5051-5052
DOI: 10.1021/ja00973a068
انسولین یک هورمون میلیارد دلاری است زیرا اختلال در تنظیم آن عامل ایجاد دیابت است. این مقاله نشان می دهد که انسولین می تواند از طریق روش های SPPS ساخته شود. ساختن انسولین دشوار است زیرا دارای 2 زنجیره (زنجیره A و B) است که از طریق پیوندهای دی سولفیدی به هم متصل شده اند. جالب اینجاست که مریفیلد با ترکیب هر دو زنجیره با تیول های محافظت شده (محافظت شده به عنوان سولفونات)، هورمون فعال را سنتز کرد، سپس آنها را به تیول کاهش داد و سپس در هوا در یک محیط پایه (PH 10) اکسید شد. این اکسیداسیون بدون جهت یا هوا نامیده می شود زیرا پیوندهای دی سولفید به طور انتخابی تشکیل نمی شوند. خوشبختانه در این مورد به درستی شکل گرفتند. امروزه به دلیل این عوارض انسولین با روش SPPS ساخته نمی شود. در عوض از طریق یک فرآیند نوترکیب ساخته می شود.
سنتز ریبونوکلئاز A
Bernd Gutte و R. B. Merrifield
مجله شیمی بیولوژیکی 1971، 246 (6)، 1922-1941
http://www.jbc.org/content/246/6/1922
این تاج دستاورد SPPS است – سنتز یک پپتید 124 مریی (یا پروتئین، در این مرحله)، RNAse A.
سنتز فاز جامد ریبونوکلئاز A توسط رابرت بروس مریفیلد
نیکول کرسژ، رابرت دی. سیمونی و رابرت ال. هیل
مجله شیمی بیولوژیکی 2006، 281 (26)، e21
http://www.jbc.org/content/281/26/e21
شرح مختصری از زندگی پروفسور مریفیلد. این نشان می دهد که او اولین نمونه اولیه یک سنتز کننده پپتید خودکار را که در زیرزمین خانه خود کار می کرد در سال 1965 توسعه داد!
سنتز فاز جامد
سخنرانی نوبل، 8 دسامبر 1984 توسط بروس مریفیلد
https://www.nobelprize.org/uploads/2018/06/merrifield-lecture.pdf
سخنرانی نوبل مریفیلد پس از دریافت جایزه نوبل شیمی در سال 1984. این شرح زندگی او، نحوه درک و توسعه فرآیند SPPS و همه پیشرفت‌هایی است که این فرآیند انجام داده است.
تابع 9-Fluorenylmethoxycarbonyl، یک گروه جدید محافظ آمینو حساس به باز
لوئیس آ. کارپینو و گریس وای هان
مجله انجمن شیمی آمریکا 1970، 92 (19)، 5748-5749
DOI: 10.1021/ja00722a043
9-گروه محافظ آمینو فلورنیل متوکسی کربونیل
لوئیس آ. کارپینو و گریس وای هان
مجله شیمی آلی 1972 37 (22), 3404-3409
DOI: 10.1021/jo00795a005
کشف و توسعه گروه Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) به عنوان یک گروه محافظ برای آمین ها، سنتز پپتید و SPPS را نیز بهبود بخشیده است.
روشی ملایم برای سنتز پپتید فاز جامد: استفاده از اسیدهای فلورنیل متوکسی کربونیلامینو
آترتون، هیزل فاکس، دایانا هارکیس، سی جی لوگان، آر. سی. شپرد و بی. جی ویلیامز
جی. شیمی. Soc. شیمی. Comm. 1978، 537-539
DOI: 10.1039/C39780000537
این اولین مقاله ای است که آنچه را که اکنون به عنوان فرآیند Fmoc/tBu SPPS شناخته می شود، توصیف می کند، که تا حد زیادی جایگزین فرآیند اصلی Boc/Bzl توسعه یافته توسط پروفسور مریفیلد شده است. مزایای Fmoc-SPPS چند برابر است، اما اصلی ترین آنها سادگی و متعامد بودن است. حفاظت آمین با یک باز انجام می شود (20٪ پیپریدین در DMF برای محافظت از یک Fmoc-amine کافی است) و جداسازی نهایی پپتید از رزین را می توان با TFA (تری فلورواستیک اسید) انجام داد، که کنترل آن بسیار آسان تر از HF است. .
پیشرفت در سنتز پپتید فاز جامد Fmoc
ریموند بهرنت، پیتر وایت و جان آفر
پپتید Sci. 2016، 22، 4-27
DOI: 10.1002/psc.2836
یک بررسی مدرن در مورد Fmoc-SPPS که شرح می‌دهد که چقدر پیشرفت کرده‌ایم و برخی از چالش‌های باقی‌مانده. به عنوان مثال، تجمع زنجیره‌های پپتیدی روی رزین یک مسئله اصلی در Fmoc-SPPS هنگام سنتز پپتیدهای آبگریز به‌ویژه است، و راه‌هایی برای مقابله با آن وجود دارد، مانند معرفی باقی‌مانده‌های «پیچیده»، مانند Pro یا استفاده از شبه‌پرولین‌ها. هنگامی که پپتید با TFA شکافته می شود، به اسیدهای آمینه مورد نظر برمی گردد. Native Chemical Ligation امروزه نیز برای سنتز پپتی های طولانی استفاده می شود